目下软骨细胞调治计谋主要基于自体软骨细胞或间充质干细胞 (MSC) 的使用。然则，这些细胞的局限性在于可用细胞数目少和软骨造成材干低。很多有计划标明，胎儿干细胞比成东谈骨干细胞更具可塑性，因此不错更灵验地分化成方向组织。然则，胎儿组织祖细胞的特征和后劲仍不甚明了。在本有计划中，咱们检讨了妊娠 12 周后东谈主类胎儿软骨细胞，并与来自年青捐赠者（8-25 岁）的骨髓繁衍 MSC 或软骨软骨细胞进行了比较。胎儿软骨繁衍祖细胞 (FCPC) 的产量连年青软骨软骨细胞逾越约 24 倍。FCPC在第0代时款式为多边形，与幼软骨细胞相似，但在第5代时款式发生变化，呈现出更接近MSC的成纤维细胞款式。跟着传代，FCPC的增殖材干明显高于幼软骨细胞和MSC姐妹花 正妹兒 身材火爆雙倍快樂，至第15代时倍增时代为2~4天。第2代FCPC的名义标记与MSC十分相似，CD29、CD90、CD105和Stro-1抒发较高。与年青软骨细胞比拟，FCPC在第10代时知晓出SA-β-半乳糖苷酶（一种败北野心）的染色明显减少，况兼直到第5代SOX9抒发才开动下跌。它们还知晓出连年青软骨细胞和MSCs更大的软骨造成后劲，非论是在体外三维颗粒培养中如故在体内聚酒精酸（PGA）支架中。此外，它们在体外不错像MSCs雷同灵验地分化为脂肪造成和成骨谱系。这些收尾标明FCPC在某种进度上具有干细胞特点，况兼在增殖和软骨分化方面连年青软骨细胞或MSCs更活跃。
一、小引
张开剩余95%要津软骨受伤后很难自我开采，因为衰败血液供应、细胞数目少、祖细胞数目有限，导致其再生材干低下。为了补充软骨缺损部位的细胞，临床上已应用了磨削和微骨折成形术等外科工夫，但这两种工夫齐与纤维软骨的造成关系，而纤维软骨更脆弱、更不耐用。自体软骨细胞移植 (ACT) 也已在临床上用于软骨再生，当作一种软骨开采计谋，已知晓出合理的效率；然则，它也有污点，即只可从患者身上取一小块软骨组织，而且软骨细胞的数目荒谬有限。此外，软骨表型和再分化潜能可能因患者而异，况兼很容易丢失，尤其是在单层培养扩增经过中，老化的软骨细胞尤其如斯。
为了克服自体软骨细胞的局限性，很多有计划运用了从多样组织（如骨髓、滑膜、脂肪或脐带血）均分离的间充质干细胞 (MSC)。MSCs 被以为是软骨再生的有招引力的细胞开端，因为它们具有很强的自我更新材干和分化成多样细胞类型的多能性，包括体外软骨细胞。关于软骨再生，MSCs 只需打针到有或莫得细胞载体的缺损区域，或者在植入前在体外分化成软骨细胞以造成软骨组织。然则，MSCs 也已被证明在体外和体内统统分化成软骨细胞并造成圆善软骨组织的材干有限。非凡是，使用 MSCs 造成的软骨组织大多会发生肥硕性变化并失去其体内软骨造成特点。
从胎儿组织（如肝脏、骨髓、血液、肺、肾、胰腺、胎盘、脑和脊髓）均分离的干细胞或祖细胞是细胞调治和组织工程有计划的另一种灵验细胞开端。它们常常阐扬出较高的多能性和增殖材干，惟恐致使比从老年供体均分离出的成体干细胞还要好。此外，来自胎儿肝脏的 MSCs 已被证实不会激发同种反馈性 T 细胞反馈，这标明胎儿干细胞不知晓同种异体免疫反馈。
此前，有几项有计划尝试将胎儿软骨繁衍细胞用于软骨组织工程。有计划东谈主员报谈，绵羊胎儿软骨细胞通过在颗粒培养中产生更多的基质分子，造成了比成东谈主软骨细胞更好的软骨组织。有计划东谈主员标明，东谈主类胎儿股骨头细胞很好地分化为软骨、脂肪和成骨谱系，但效率低于骨髓 MSCs。这些有计划标明胎儿软骨繁衍细胞可能是软骨再生的潜在细胞开端，但有必要进一步细目胎儿软骨繁衍细胞的特征和调治效能，以用于其他临床应用。在这项有计划中，咱们有计划了胎儿软骨繁衍祖细胞 (FCPC) 的特征，并与骨髓 MSCs 和年青软骨细胞进行了比较，比较了它们的传代增殖材干、可塑性以及体外和体内的软骨造成后劲。
二、材料与方法
2.1 细胞分离与培养
本有计划经亚洲大学医学中神思构审查委员会 (IRB) 批准 (AJIRB-CRO-07-139)，并在统统捐赠者的书面应承下进行。从妊娠 12 周后选拔性间隔妊娠的患者中获取东谈主胎儿软骨组织 (n = 4，M12w-a、M12w-b、F12w-c、M11w)，并从软骨组织的股骨头均分离细胞。从 11~25 岁创伤后手术患者的膝要津软骨组织均分离年青软骨细胞 (n = 3，M11y、M18y、M25y)。从剿袭全膝要津置换手术的三名捐赠者的膝要津软骨组织均分离老年软骨细胞 (n = 3，F45y、M54y、F56y)。将软骨组织切碎成小块，在含有 1% 胎牛血清 (FBS; HyClone) 的高葡萄糖 Dulbecco 纠正 Eagle 培养基顶用 0.1% 2 型胶原酶处理，在 37℃、5% CO2 的条目下进行。12 小时后，将分离的细胞在含有 10% FBS、100 U/ml 青霉素 G 和 100 μg/ml 链霉素 (Pen-Strep; HyClone) 的 DMEM 中培养，密度为 8 × 10^3 细胞/cm²。MSCs 是从 8~25 岁手术患者 (n = 3，F8y、M11y、M25y) 的股骨骨折骨髓均分离出来的。简而言之，通过 Ficoll 梯度离心网络单核细胞 (MNC)，悬浮在补充有 10% FBS 的 α-纠正 Eagle 培养基 (α-MEM; HyClone) 中，并以 8 × 10^4 细胞/cm² 的密度接种。6 天后，去除未粘附的细胞，并用清新培养基补充粘附的 MSCs。细胞在 80% 汇合时传代，其中接种密度约为 8 × 10^3 细胞/cm²。
2.2 流式细胞术分析
分析第 2~3 代细胞在细胞名义的干细胞标记物的抒发情况。将悬浮液中的细胞与抗CD34-FITC、抗CD29-PE、抗CD90-FITC、抗CD105-FITC和抗Stro-1抗体在4℃下孵育40分钟。关于抗Stro-1抗体，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，然后在4℃下与山羊抗小鼠IgM-FITC（R&D Systems）孵育30分钟。证据制造商的说明细目每种抗体的稀释倍数。通过流式细胞术分析染色的细胞。
2.3 mRNA水等分析
使用TRIzol试剂从细胞中索要总RNA。使用1微克RNA通过逆转录合成cDNA。使用 0.5 mg 合成的 cDNA 和胶原卵白 II、SOX9、辘集卵白聚糖、胶原卵白 I 和 GAPDH 的特异性引物进行 PCR。引物序列和反馈条目列于表 1 中。使用 SYBR Premix Ex Taq 用 CFX Connect PCR 仪进行定量及时 PCR。统统反馈均重叠，并将 (性别决定区 Y)-box 9 (SOX9) 和胶原卵白 II α 1 (COL2A1) 的每个扩增信号措施化为甘油醛 3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 的信号。
表 1. 用于逆转录-团聚酶链反馈的引物。
2.4 细胞败北测定
使用败北细胞组织化学染色试剂盒通过败北关系 β-半乳糖苷酶 (SA-β-gal) 染色细目败北细胞。通俗来说，细胞先在室温下固定6分钟，然后在37℃、无CO2的条目下与染色搀杂物孵育8小时。在显微镜下不雅察到败北细胞呈蓝色。
2.5 多谱系分化
关于成骨和成脂分化，将细胞差别以 2 × 10^3 细胞/cm² 和 2 × 10^4 细胞/cm² 的密度接种于六孔板。24 小时后，将细胞培养于各谱系的分化培养基中。成骨培养基由 α-MEM 构成，其中补充了 10% FBS、10 mM β-甘油磷酸盐、100 nM 地塞米松和 50 μg/ml 抗坏血酸-2 磷酸盐。脂肪生成培养基由添加 10% FBS、1 μM 地塞米松、10 μg/ml 胰岛素、0.5 mM 异丁基甲基黄嘌呤和 0.1 mM 吲哚好意思辛的 α-MEM 构成。对照细胞在添加 10% FBS 的 α-MEM 中孵育 3 周。分化 3 周后，用茜素红 S和油红 O对细胞进行染色，差别不雅察矿化进度和脂滴。为了进行定量分析，用 3 ml 10% 乙酸和 1.5 ml 10% 氢氧化铵司）洗脱吸附的染料（茜素红 S），用 1 ml 异丙醇洗脱油红 O。差别在 405 nm 和 500 nm 处测量吸光度。为了呈现数据，分化样品的值通过未分化细胞的对照值进行措施化。
关于软骨分化，将 3 × 10^5 个细胞以 500 × g 离心 5 分钟，并将细胞千里淀物培养在软骨培养基中。软骨造成培养基由 DMEM 构成，其中添加了 100 nM 地塞米松、50 μg/ml 抗坏血酸-2 磷酸盐、ITS 补充剂 、40 μg/ml 脯氨酸 、1.25 mg/ml 牛血清白卵白 、100 μg/ml 丙酮酸钠 和 10 ng/ml TGF-β3 。团结 3 周后，用 4% 甲醛 固定样品并镶嵌石蜡中。制备厚度为 4 μm 的切片并用 Safranin O 染色以不雅察硫酸化糖胺聚糖 。
2.6 体内软骨组织造成
为了有计划软骨组织造成的可能性，将细胞接种在支架中，并皮下植入 BALB/c 裸鼠的背部。简而言之，将 5 × 10^6 个细胞接种在直径为 5 毫米、高度为 2 毫米的 PGA 支架中。将细胞-PGA 构建体在上述软骨培养基中培养 1 周，然后植入裸鼠体内。为了尽量减少动物的个体互异，改日自统统不同组的一组构建体植入裸鼠体内（每组 n ≥ 3）。在植入后 1、2 和 4 周对造成的组织进行取样。京畿科学工夫振兴院动物实验机构委员会审查并批准了动物实验决议。
东莞市富临塑胶原料有限公司 是 PGA Biofelt植入级无纺布的大师，富临塑胶为客户提供“干事”和“PGA Biofelt无纺布”。
2.7 组织学和免疫组织化学
样本用 4% 甲醛固定并镶嵌石蜡中。4 μm 厚的切片用 Safranin O 和 von Kossa 染色差别染色以识别 sGAG 和钙千里积的进度。关于胶原卵白 II 的免疫组织化学分析，切片用甲醇中的 3% 过氧化氢处理 10 分钟，并与胃卵白酶溶液反馈 10 分钟。用 PBS 中的 1% BSA 闭塞切片后，在室温下与抗胶原卵白 II 抗体或抗胶原卵白 X 抗体孵育 1.5 小时。然后将切片与针对小鼠 IgG 的生物素化二抗（SPlink HRP 检测试剂盒；Golden Bridge International）孵育 30 分钟，并与过氧化物酶偶联的链霉亲和素溶液（SPlink HRP 检测试剂盒；Golden Bridge International）孵育 30 分钟。终末，将切片与 3，3'-二氨基联苯胺 (DAB) 溶液反馈，并在装配前用 Mayer 苏木精复染。
2.8 统计分析
使用 SPSS 12.0.1 通过单成分方差分析 (ANOVA) 和 Tukey 过后探员分析多谱系分化实验的定量数据。p < 0.05 的值被视为具有统计学真理。
三、收尾
3.1 FCPCs的分离与强硬
取妊娠12周的股骨髁东谈主胎儿软骨组织，经番红O染色检测sGAG，进行组织学不雅察，并与年少软骨组织进行比较。如图1A所示，胎儿软骨组织细胞分散均匀，数目多，密度高。未不雅察到继发性骨化和肥硕性软骨细胞的迹象。免疫组织化学分析知晓，胶原卵白II在胎儿软骨组织周围高抒发，而胶原卵白I则统统不抒发（图1B）。分离细胞后，每1g组织中的FCPC数目比从年少软骨组织均分离出的软骨细胞数目逾越约24倍（图1C）。FCPC 在款式上与软骨细胞更相似，两者齐呈三角形，而与从骨髓均分离的东谈主类 MSC 比拟则更相似（图 1D）。这些收尾标明胎儿软骨组织可能是一种雅致的细胞开端，不错从有限量的组织中提供多数软骨细胞。
图 1. 从东谈主类胎儿软骨组织均分离 FCPC。（A）用番红 O/快绿染色法对妊娠 12 周后的东谈主类胎儿软骨组织（a、b）和年青软骨组织（c、d）进行硫酸化糖胺聚糖染色，并在显微镜下不雅察。（B）对东谈主类胎儿软骨组织进行胶原卵白 II（上图）和胶原卵白 I（下图）的免疫染色。(C) 比较了从 1g 组织均分离出的 FCPC（n = 4）和从每种组织均分离出的年青软骨细胞（n = 3）的细胞产量。(D) 不雅察了 24 小往往的 FCPC 和软骨细胞以及首次接种后 6 天时的 MSC 的款式。Y-Chon，年青软骨细胞。
3.2 FCPC 随传代的表型变化
败北或去分化导致细胞增殖和活性镌汰是软骨细胞和 MSC 调治用途濒临的主要挑战。因此，咱们检讨了 FCPC 在传代经过中的增殖材干和表型。FCPC 的倍增时代在第 1 代时约为 2.2 ± 0.6，至少在第 15 代之前莫得显着加多（图 2A）。东谈主类软骨细胞和 MSC 的倍增时代跟着传代而显赫加多，尽管这些值在第 7 代时无法施行测量。FCPC 的总细胞数马上加多，在第 7 代时达到约 1.3 × 10^10 个细胞，在第 11 代时达到 6.9 × 10^12 个细胞（图 2B，左）。比拟之下，年少软骨细胞和 MSC 在第 7 代时期别唯有约 1.7 × 10^8 个细胞和 1.3 × 10^8 个细胞。跟着时代的推移缠绵累积细胞数目时知晓出荒谬显赫的互异，收尾是 40 天时 FCPC 中有 2.2 × 10^10 个细胞，年少软骨细胞中有 2.2 × 10^7 个细胞，MSC 中有 4.7 × 10^7 个细胞（图 2B，右）。因此，FCPC 的增殖材干明显不同于东谈主类年青软骨细胞和 MSC，跟着传代次数的加多而马上下跌，这在畴前的有计划中也有报谈。
图 2. FCPC 的传代增殖。(A) 将 FCPC 的倍增时代与东谈主类软骨细胞和 MSC 的倍增时代进行比较，直到第 15 代 (n = 3)。细胞在 80% 汇合时进行传代培养。倍增时代使用以下公式缠绵：DT = (T1 - T0)log2/(log N1 - log N0)，其中 T1 - T0 = 培养期（以天为单元），N0 = 接种细胞数，N1 = 收货细胞数。(B) 缠绵每组中的累积细胞数，并缠绵传代次数（左）或天数（右）。Y-Chon，年青软骨细胞。平均值以措施差 (SD) 示意。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001。
当检讨软骨细胞富集基因的抒发水奏凯至第 5 代时，SOX9 经久高抒发。胶原卵白 II (COL2A1) 幽静下跌，但其在 FCPC 中的抒发仍高于软骨细胞（图 3A）。出其不意的是，直到第 5 代，辘集卵白聚糖在 FCPC 和软骨细胞中的抒发齐保捏较高水平。胶原卵白 I (COL1A2) 的抒发（软骨细胞去分化的标记物）在两种细胞类型中齐跟着传代而加多，但在软骨细胞中发生得更快。这些收尾标明，FCPC 具有高度增殖性，况兼在传代经过中保捏了雅致的软骨表型。当在老化的软骨细胞中检讨时，证据 RT-PCR 和定量及时 PCR 分析，发现 SOX9 和胶原卵白 II 的抒发跟着传代而马上下跌（图 3B、C）。
图 3. FCPC 的传代基因抒发分析。（A）通过 RT-PCR 说明 FCPC 和软骨细胞中软骨细胞特异性基因的抒发。在 1-5 代 FCPC 和年青软骨细胞中检测了 SOX9、COL2A1（胶原卵白 II，α 1）、ACAN（辘集卵白聚糖）和 COL1A2（胶原卵白 I，α 2）的 mRNA 水平。测量了甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 的 mRNA 水平当作管家对照。通过 RT-PCR (B) 或定量及时 PCR (C) 分析检讨了 FCPC 和从 45-56 岁捐献者处赢得的老化软骨细胞中的 SOX9 和 COL2A1 的 mRNA 水平（FCPC；n = 3/捐献者，老化软骨细胞；n = 3/捐献者，F45y、M54y、F56y）。Y-Chon，年青软骨细胞。**p < 0.01。
在款式学不雅察中，FCPC 在第 5 代时变为成纤维细胞体式，但未知晓在澌灭代中在东谈主类软骨细胞和 MSC 中不雅察到的败北细胞的扁平款式（图 4A）。FCPC 的成纤维细胞样款式一直保捏到第 15 代，莫得发生显赫变化（数据未知晓）。在大多数东谈主类软骨细胞和 MSCs 中，第 10 代时通过 SA-β-gal 染色可识别出败北细胞，而在 FCPCs 中很少检测到败北细胞（图 4B）。
图 4. 传代 FCPC 的款式。(A) 与第 1 代和第 5 代不雅察到的年青 MSCs 和软骨细胞比拟，检讨了 FCPC 的款式。(B) 通过 SA-β-gal 染色在第 10 代识别出败北细胞。深色染色的细胞代表败北细胞。Y-Chon，年青软骨细胞。
3.3 FCPC 的名义标记物概况
为了细目 FCPC 是否具有祖细胞或干细胞的特点，领先通过流式细胞术检讨了 MSCs 中富含名义标记物的 FCPC 的抒发，并与第 2 代阶段的东谈主类 MSCs 和软骨细胞进行了比较。收尾知晓，这三种细胞类型均以相对较高的水平抒发 CD90 和 CD105，而不抒发 CD34（表 2）。它们还知晓 CD29 和 Stro-1 有抒发，但水平不同，在 FCPC 中抒发最高，其次是 MSC 和软骨细胞。Stro-1 在软骨细胞中的抒发水平仅为 11.0 ± 2.4%。
表 2. 流式细胞术检测 FCPC、软骨细胞和 MsC 上干细胞标记物的抒发。
3.4 FCPC 体外多向分化材干
与东谈主类 MSC 和软骨细胞比拟，检讨了 FCPC 的多向分化材干，包括成骨、脂肪造成和软骨造成。第 2 代细胞在体外分化成每个谱系 3 周。在软骨造成经过中，FCPC 颗粒的尺寸在第 1 天最小，但在第 3 周显赫加多，以至于从肉眼不雅察与软骨细胞颗粒的尺寸荒谬（图 5A）。软骨细胞颗粒的尺寸在第 1 天最大，但在第 3 周莫得显赫加多，而 MSC 颗粒的尺寸在第 3 周反而减小。番红 O 染色的组织学图像也知晓 FCPC 中的 sGAG 信号强，证实它们已很好地分化为软骨样组织。FCPC 的软骨造成潜能在第 5 代保捏雅致，但在第 10 代显赫镌汰（图 5B）。在成骨和脂肪造成经过中，FCPC 在茜素红 S 和油红 O 染色中也差别知晓出最强的信号（图 6A、B）。继 FCPC 之后，接下来是 MSC，而软骨细胞确切莫得成骨和脂肪造成的后劲。FCPC 统统矿化，成骨经过中莫得个体互异，脂肪造成经过中的脂滴细胞比 MSC 更多。染色收尾在图中呈现的定量数据中得到了统计证实。这些收尾标明，FCPC 具有祖细胞或干细胞特点，与年青骨髓 MSC 比拟，其多谱系分化材干更强。
图 5. FCPC 体外的软骨分化后劲。(A) 将第 2 代的 FCPC、MSC 和软骨细胞制成颗粒状，并在特定培养基均分化为软骨谱系 3 周（n ≥ 3）。在大体图像中，刻度以 1 毫米为单元（顶部）。3 周的样本用 Safranin O 进行组织学染色（中间和底部）。(B) 第 2、5 和 10 代 FCPC 进行如上所述的软骨发陌生化，并呈现 Safranin O 图像。Y-Chon，年青软骨细胞。
图 6. FCPC 体外成骨和成脂分化潜能。第 2 代 FCPC、MSC 和软骨细胞分化为 (A) 成骨和 (B) 成脂谱系 3 周，并用茜素 S 和油红 O 染色，差别不雅察钙千里积和脂滴的进度（n = 3/供体）。为了进行定量分析，将吸附的染料洗脱，并在 450 nm 处测量茜素 S 的吸光度，在 500 nm 处测量油红 O 染色的吸光度。用对照值措施化的值示意为至少三个孤独实验的平均值和措施差 (SD)。***p < 0.001。Y-Chon，年青软骨细胞。
3.5 FCPC 体内软骨组织造成
欧美图片为了评估 FCPC 体内软骨造成后劲，三种细胞在 PGA 支架中体外培养 1 周，并植入裸鼠背部 1、2 和 4 周。从大体不雅察，植入前（体外 1 周）构建体尺寸确切疏通，但不同细胞构建体的尺寸随时代发生显赫变化（图 7A）。FCPC 构建体的尺寸渐渐增大，软骨细胞构建体的尺寸变化不大，MSC 构建体的尺寸减小。植入 4 周后 FCPC 构建体的尺寸是植入前的两倍。非凡是，4 周后的 FCPC 构建体很容易从裸鼠皮肤上取出，与其他构建体比拟，其名义荒谬光滑。sGAG 和胶原卵白 II 的组织学不雅察进一步证实，FCPC 构建体在体内造成了最高质料的软骨组织。4 周时，FCPC 构建体知晓出 sGAG 的多数蓄积和通盘构建体中发育雅致的陷窝造成（图 7B）。MSC 构建体不可很好地分化为软骨细胞，在体内造成了质料较差的软骨组织。还不雅察到胶原卵白 II 的抒发在通盘 FCPC 构建体中齐很显赫，但它仅发生在软骨细胞和 MSC 构建体的周围区域（图 7C，顶部）。非凡是，证据 4 周时构建体周围区域的 von Kossa 染色，MSC 知晓出多数的胶原卵白 X 抒发和钙千里积，这代表了基质矿化和肥硕性变化的典型表型（图 7C，中间和底部）。在 FCPC 或软骨细胞构建体中未不雅察到这种时局。
图 7. FCPC、软骨细胞和 MSCs 在体内造成软骨组织。将细胞接种在 PGA 支架中，并在体外分化为软骨细胞系 1 周（n ≥ 3）。然后将构建体皮下植入裸鼠背部 1、2 和 4 周，然后进行分析。（A）体外 1 周和体内 1、2 和 4 周的样品大体图像。刻度以 1 毫米为单元。（B）从体内样品制备组织切片并用 Safranin O 染色。（C）对 4 周的样品进行胶原卵白 II（顶部）、胶原卵白 X 和 von Kossa 染色（底部）的免疫染色。Y-Chon，年青软骨细胞。
四、征询
在本有计划中，咱们证明了东谈主类胎儿软骨开端的祖细胞 (FCPC) 当作软骨再生新细胞开端的后劲。咱们的收尾标明，FCPC 不错以高产量赢得（每 1 克组织 6.5 ± 0.95 × 10^7 个细胞），况兼它们在体外增殖雅致，高出 15 代，莫得明显的滋长迟缓。收尾还标明，与东谈主类年青软骨细胞和骨髓 MSCs 比拟，FCPC 不仅具有向软骨造成谱系的多能分化材干，而且具有向脂肪造成谱系和成骨谱系的多能分化材干。非凡是，它们在软骨组织造成方面比骨髓 MSCs 好得多，但在体内莫得发生肥硕性发育。这些收尾标明，FCPC 至少不错当作软骨再生和组织工程的合适细胞开端。来自多样胎儿组织的细胞被以为连年青或成东谈主细胞更原始；然则，它们也被以为比成体干细胞如MSCs具有更强的分化成特定谱系的材干。有计划东谈主员的有计划收尾也知晓，孕后14～16周的胎儿软骨开端细胞具有更强的软骨造成材干，而在脂肪造成和成骨分化方面，其效率低于骨髓MSCs。但本有计划收尾领导，孕后12周的FCPC虽具有比MSCs更强的软骨造成材干，但仍具有更好的增殖材干，以及在体外特定条目下向多谱系分化的可塑性。
尽管从胎儿赢得的软骨组织量很少，但由于这种组织的细胞含量高，因此收货了多数 FCPC。在本有计划中，从胎儿软骨中赢得的细胞数目（每 1 克组织 6.5 ± 0.95 × 10^7 个细胞）远庞大于来自 11~25 岁捐赠者的软骨组织（每 1 克组织 2.7 ± 0.23 × 10^6 个细胞）。之前的一些有计划也答复说，纯熟软骨比未纯熟软骨有更大的软骨细胞和更低的细胞与基质比。咱们还发现，如有计划东谈主员的图像所示，咱们在妊娠 12 周的胎儿软骨组织的细胞含量似乎比妊娠 15 周的胎儿软骨组织逾越约两倍。计议到 ACT 在获取填塞量的健康组织时荒谬有限，FCPC 不错通过提供多数活性和软骨细胞而成为自体软骨细胞的雅致替代品。
老年患者的自体软骨细胞在调治应用中也受到截至，因为它们在传代经过中具有去分化特点，举例滋长迟缓、软骨细胞表型丧失以及软骨组织造见效率低下。无人不晓，在捐赠者年岁高出 30~40 岁后，老年软骨细胞的增殖率会镌汰。此外，它们常常在平均约五次传代培养后去分化并失去其软骨表型。比拟之下，本有计划中的 FCPC 保捏了雅致的增殖材干，致使直到第 15 代。跟着传代的进行，FCPC 的软骨分化材干有所下跌，但这可能至少部分是由于颗粒培养环境不利。在自然三维支架中测试时，它们的软骨造成材干在第 2 代和第 5 代莫得显赫互异（数据未知晓）。跟着传代的进行，胶原卵白 II 的抒发也有所下跌，而 SOX9 的抒发仍然很高，在 FCPC 中直到第 5 代齐莫得下跌。SOX9 是一种转录因子，可调整富含软骨细胞的基因（如胶原卵白 II）的抒发；它参与发育阶段中轴骨骼的软骨造成。在软骨内骨的发育经过中，SOX9 的抒发在间充质细胞凝合阶段直至软骨细胞分化阶段均有不雅察到，并在振荡为肥硕前软骨细胞时下调。在本有计划中，FCPC 在传代经过中知晓出高水平的 SOX9 基因抒发，很可能是因为它是在软骨细胞纯熟阶段之前分离的。咱们算计，高水平的 SOX9 抒发也与 FCPC 在颗粒培养中至少到第 5 代时造成高质料软骨组织的发现存关。
胎儿软骨是一种未统统分化为软骨的未纯熟组织，而 FCPC 可能具有一些干细胞特点，举例自我更新和多向分化材干。本有计划中的 FCPC 不仅阐扬出向软骨细胞的多向分化材干，还阐扬出向脂肪造成和成骨谱系的多向分化材干。证据咱们的有计划收尾，它们的材干高于来自 8-25 岁供体的骨髓 MSCs。将 FCPC 强制分化为其他细胞谱系（举例神经元和肝细胞）的效率并不高（数据未知晓），这标明 FCPC 的材干仅限于 MSCs 等中胚层细胞谱系。很多有计划答复称，去分化的东谈主类要津软骨细胞莽撞塑性为多向细胞。具体而言，克隆的软骨祖细胞的端粒酶活性比非克隆的去分化软骨细胞高 2.6 倍，但它们的多能性在不同的克隆中高度异质。在咱们的有计划中，年青的软骨细胞也阐扬出一定的分化材干，不错分化为脂肪造成和成骨谱系，这种分化材干跟着供体的年岁增长而镌汰（数据未知晓）。然则，它们的材干还不及以被视为具有多能性。
为了有计划FCPC的干细胞特点而进行的名义标记物分析标明，除CD29和Stro-1外，三种细胞类型之间莫得显赫互异。值得难得的是，两种无人不晓的MSC标记物CD29和Stro-1在FCPC中的抒发最高，其次是MSC和软骨细胞。CD29是整合素β1，在细胞-细胞或细胞-基质互相作用中起缺陷作用。之前有东谈主建议它在悬浮培养经过中介导软骨细胞辘集。计议到间充质凝合在软骨发育早期的紧迫性，CD29也可能在FCPC的软骨分化和软骨组织造成中阐述紧迫作用。Stro-1是骨髓MSC的标记物，高抒发Stro-1的细胞被以为比不抒发Stro-1的细胞更原始。这其中的真理需要进一步敷陈。
MSCs是软骨再生与组织工程的雅致细胞开端，但其仍存在分化不充分、体内经久植入后软骨造成表型丢失等污点。这已经过被称为肥硕性发育，触及软骨基质分子的丢失、钙的千里积和基质的矿化。肥硕性发育的原因尚不明晰，有计划标明通过使用一些机械刺激或支架材料可在一定进度上减速肥硕性发育，但无法统统克服。在咱们前期运用兔骨髓MSCs的有计划中，含有较多卵白多糖的工程软骨阐扬出较少的肥硕性改造，况兼组织学和免疫组织化学不雅察中Safranin O阴性区域与肥硕区域匹配雅致。在本有计划中，FCPC不仅阐扬出较高的软骨组织造成材干，而且在体内直到4周才出现肥硕性发育。因此，FCPC具有上述干细胞特点，但与MSC有着本体的区别。咱们以为 FCPC 同期具有软骨细胞和 MSC 的上风。有计划东谈主员估量胎儿软骨含有来自次级骨化中心的细胞，并标明胎儿软骨细胞抒发胶原卵白 X，标明在软骨团结培养基存鄙人会造成肥硕性软骨细胞。在本有计划中，咱们还发当今体内由 FCPC 造成的软骨组织中莫得抒发胶原卵白 X。因此，计议到 FCPC 造成高质料软骨组织的材干，咱们算计即使经过较万古间的培养，FCPC 也不会搪塞变得肥硕。
关于 FCPC 的临床应用，应惩办与免疫原性关系的紧迫截至。有计划东谈主员答复称，年少软骨细胞衰败 HLA-DR、CD80 和 CD86 等细胞名义标记物，这些标记物认真在细胞水平上团结免疫反馈，况兼它们不会刺激体内的免疫反馈。CD80 和 CD86 在年青软骨细胞（年岁 >20 岁）中抒发，但在年少软骨细胞（年岁 < 6 岁）中不抒发。此外，一些有计划答复称，来自多样胎儿组织或胎儿骨细胞的 MSCs 具有较低的免疫关系特点。因此，咱们进一步的责任将荟萃于展示 FCPC 的免疫关系特点和克隆表征，以赢得更同质和更原始的 FCPC。FCPC 的另一个紧迫问题是使用胎儿组织的伦理问题。致使有野心受孕以捐赠和调治胎儿组织或细胞的案例。咱们矍铄反对这种蹧跶胎儿组织的举止，并观念用于调治用途的胎儿组织应从因当然原因在子宫内失掉的胎儿身上获取，与任何与打胎关系的决定无关。此外，医疗和工夫法子应安妥赫尔辛基宣言。在韩国，咱们有明确的胎儿使用指南和规矩，IRB 也对这些指南和规矩进行了妥善不休。确保安妥伦理和法律准则的 FCPC 开端雅致，应该是 FCPC 营业化的下一个任务之一。
总之，咱们有计划了东谈主类 FCPC 的特征，并与东谈主类骨髓 MSCs 和年青软骨细胞进行了比较。东谈主类 FCPC 阐扬出 MSCs 和软骨细胞的特征，具有高增殖和多谱系分化材干，况兼在体外和体内具有出色的软骨造成后劲。然则，在计议将 FCPC 用于调治用途之前，仍存在伦理方面的计议，应该深化征询。
东莞市富临塑胶原料有限公司供应“PGA Biofelt无纺布”。公司地址：广东省东莞市樟木头镇塑金外洋1号楼810
发布于：广东省